按現代的觀(guān)念，凡是混入培養環(huán)境中對細胞生存產(chǎn)生有害的成分和造成細胞不純的異物都應該視為污染。根據這一概念，組織培養污染物應包括生物（真菌、細菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)（影響細胞生存、非細胞所需的化學(xué)成分）、細胞（非同種的其他細胞）。其中一微生物最為多見(jiàn)。另外，隨著(zhù)使用細胞種類(lèi)增多，不同細胞交*污染，尤其是Hela細胞的污染也時(shí)有發(fā)生，從而造成細胞不純。

一、污染途徑

污染物，特別是微生物常通過(guò)下列途徑進(jìn)入培養體系，造成污染

1 空氣：

空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑?？諝饬鲃?dòng)性大，如果培養操作場(chǎng)地于外界隔離不嚴格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養設施不能設在通風(fēng)場(chǎng)所。無(wú)菌操作應在凈化臺內進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩，以免因講話(huà)、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面，造成污染。

2 器材：

各種培養器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導致污染，另外需要對培養箱進(jìn)行定期消毒，防止形成污染

3 操作：

實(shí)驗操作無(wú)菌觀(guān)念不強，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴等，都可以造成污染。培養兩種細胞以上時(shí)，操作不規范，交*使用吸管或培養液、瓶等有可能導致細胞交*污染。

4 血清：

有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5 組織樣本：

原代培養的污染多數來(lái)源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細胞或培養液中，影響細胞細胞生長(cháng)。

二、污染對培養細胞的影響及污染的檢測

由于體外培養細胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而且培養基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養細胞一旦發(fā)生污染多數將無(wú)法挽回。細胞污染早期或污染程度較輕時(shí)，如果能及時(shí)去除污染物，部分細胞有可能恢復、但是當污染物持續存在培養環(huán)境中，輕者細胞生長(cháng)緩慢，分類(lèi)象減少，細胞變得粗糙，輪廓增強細胞漿出現顆粒、污染較嚴重，細胞增值停止，分裂象消失，細胞質(zhì)中出現大量堆積物，細胞變圓、脫壁。

（一）細菌污染對培養細胞的影響及污染物的檢測

常見(jiàn)的污染細菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細菌污染初期由于培養體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細胞生長(cháng)不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀(guān)察不易判斷。懷疑培養細胞有細菌污染時(shí)，取10ml細胞懸液離心1000轉5分鐘，沉淀中加入無(wú)抗生素培養液2ml,將細胞放培養箱培養。

如果培養無(wú)真的細菌污染，24小時(shí)內可以獲得陽(yáng)性結果。當污染的細菌量比較大或者細菌增殖到一定基數時(shí)，大約每20分鐘一代，會(huì )使培養系統中很快產(chǎn)生大量細菌，后者不僅可以消耗培養系統中的養分，還能釋放大量代謝產(chǎn)物。幾個(gè)小時(shí)后，增殖的細菌就可以導致培養液外觀(guān)渾濁，肉眼就可以判斷。細菌污染大多數可以改變培養液pH，使培養液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀(guān)察，可見(jiàn)滿(mǎn)視野都是點(diǎn)狀的細菌顆粒，原來(lái)的清晰培養背景變得模糊，大量的細菌甚至可以覆蓋細胞，對細胞的生存構成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預防細菌污染有效。

（二）真菌污染對細胞的影響及污染物的檢測

微生物污染中以真菌最多，真菌種類(lèi)繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于發(fā)現，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養液表面，肉眼可見(jiàn)；有的散在生長(cháng)，鏡下可見(jiàn)呈絲狀、管狀、樹(shù)枝狀，縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細胞周邊和細胞之間生長(cháng)。真菌生長(cháng)迅速，能在短時(shí)間內抑制細胞生長(cháng)、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細胞?？拐婢苿︻A防和排除真菌污染有效。

（三）支原體污染對細胞影響及污染物的檢測

細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題,是細胞培養最常見(jiàn)的、干擾試驗結果的一種污染。但由于不易被察覺(jué)，有些污染的細胞仍在被應用。研究表明，95％以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見(jiàn)的污染細胞培養的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類(lèi)是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。據查，目前各實(shí)驗室使用的二倍體細胞和傳代細胞中約有11%的細胞受到支原體污染。

污染來(lái)源包括工作環(huán)境污染、操作者本身污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養基污染、污染支原體的細胞造成的交*污染、實(shí)驗器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后，因為它們不會(huì )使細胞死亡可以與細胞長(cháng)期共存，培養基一般不發(fā)生渾濁，細胞無(wú)明顯變化，外觀(guān)上給人以正常感覺(jué)，實(shí)則細胞手到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響DNA合成，抑制細胞生長(cháng)等。

細胞培養中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預防支原體的污染：
    控制環(huán)境污染；
    嚴格實(shí)驗操作；
    細胞培養基和器材要保證無(wú)菌；
    在細胞培養基中加入適量的抗生素。

支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體最突出的結構特征是沒(méi)有細胞壁，一般來(lái)講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等完全不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內酯類(lèi)及一些氟喹諾酮；其他類(lèi)抗生素如氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來(lái)作為支原體感染的化學(xué)治療劑。

（四）細胞交叉污染對細胞的影響及污染物的檢測

細胞培養中，細胞間交*污染并不罕見(jiàn)，多是由于在培養中操作時(shí)各種細胞同時(shí)進(jìn)行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細胞的生長(cháng)特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化，有些變化較輕、不易察覺(jué)，有些可能由于污染的細胞具有生長(cháng)優(yōu)勢最終壓過(guò)原來(lái)細胞而導致細胞的生長(cháng)抑制，最終死亡。常用觀(guān)察細胞形態(tài)學(xué)、分析生長(cháng)特性和核型、檢測細胞的標記物等方法檢測交*污染的細胞。

三、污染的預防:

防止污染，預防是關(guān)鍵，預防措施應該貫穿整個(gè)細胞培養的始終。

1.器皿準備中的預防：

用于細胞培養的器皿應該嚴格消毒，做到真正潔凈；應該無(wú)菌的物品，要做到消毒嚴格、真正無(wú)菌；器皿的運輸、貯存過(guò)程中，要嚴格操作，謹防污染。

2.開(kāi)始操作前的預防：

應當按廠(chǎng)家規定，定期清洗或更換超凈臺的空氣濾網(wǎng)，請專(zhuān)職人員定期檢查超凈臺的空氣凈化標準；檢查培養皿是否有消毒標志，有條件得實(shí)驗室可以使用一次性用品；檢查新配置的培養液，確認無(wú)菌方可使用；操作前提前半小時(shí)啟動(dòng)超凈臺的紫外燈消毒；操作應戴口罩，消毒雙手。

3.操作過(guò)程中的預防；

主要包括：超凈臺內放置的所有培養瓶瓶口不能與風(fēng)向相逆，不允許用手觸及器皿的無(wú)菌部分，如瓶口和瓶塞內側；在安裝吸管冒、開(kāi)啟或封閉瓶口操作時(shí)要經(jīng)過(guò)酒精燈燒灼，并在火焰附件工作；吸取培養液、細胞懸液等液體時(shí)，應專(zhuān)管專(zhuān)用，防止污染擴大或造成培養物的交*污染；使用培養液前，不易較早開(kāi)啟瓶口；開(kāi)瓶后的培養瓶應保持斜位，避免直立；不再使用的培養液應立即封口；培養的細胞在處理之前不要過(guò)早的暴露空氣中；操作時(shí)不要交談、咳嗽，以防唾沫和呼出氣流引發(fā)污染；操作完畢后應將工作臺面整理好，并消毒擦拭工作面，關(guān)閉超凈臺。

4.其他預防：

及早凍存培養物；重要的細胞株傳代工作應有兩個(gè)人獨立進(jìn)行；購入的未滅活血清應采取56度水浴滅活30分鐘使血清的補體和支原體滅活；為了避免誘導抗藥細菌，應定期更換培養系統的抗生素，或盡可能不用抗生素；對新購入的細胞株應加強觀(guān)察，防止外來(lái)的污染源；定期消毒培養箱。

四、污染的排除:

培養的細胞一旦污染應及時(shí)處理，防止污染其他細胞。通常選高壓滅菌被污染的細胞，然后棄掉。如果有價(jià)值的細胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過(guò)及時(shí)排除污染物，挽救細胞恢復正常。常用的排除微生物污染的方法有以下幾種：

1 抗生素排除法：

抗生素是細胞培養中殺滅細菌的主要手段。各種抗生素性質(zhì)不同，對微生物作用也不同，聯(lián)合應用比單用效果好，預防性應用比污染后應用好；如果發(fā)生微生物污染后再使用抗生素，常難以根除。有的抗生素對細菌僅有抑制作用，無(wú)殺滅效應。反復使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量不用抗生素處理，當然，一些有價(jià)值的細胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用5－10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24－48小時(shí)，再換入常規的培養液，有時(shí)可以奏效。

2 加溫除菌：

根據支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細胞置于41度中作用5－10小時(shí)（最長(cháng)可以達18小時(shí)）殺滅支原體。但是41度對細胞本身應有較大影響，故在處理前，應先進(jìn)行預試驗，確定最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時(shí)間。

3 動(dòng)物體內接種：

受微生物污染的腫瘤細胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內免疫系統消滅掉微生物，腫瘤細胞卻能在體內生長(cháng)，待一定時(shí)間，從體內取出再進(jìn)行培養繁殖。

4 與巨噬細胞共培養：

在良好的體外培養條件下巨噬細胞可以存活7－10天，并可以分泌一些細胞因子支持其他細胞的科隆生長(cháng)。與體內情況相似，巨噬細胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培養細胞與巨噬細胞共培養，可以在高度稀釋培養細胞、極大地降低微生物污染程度地同時(shí)，更有效地發(fā)揮巨噬細胞清除污染地效能。本方法與抗生素聯(lián)合應用效果更佳。