一、微載體培養應用

此技術(shù)于1967年被用于動(dòng)物細胞大規模培養。經(jīng)過(guò)三十余年的發(fā)展，該技術(shù)目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。微載體培養是目前公認的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細胞大規模培養技術(shù)，其兼具懸浮培養和貼壁培養的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。目前微載體培養廣泛用于培養各種類(lèi)型細胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細胞、成肌細胞、Vero細胞、CHO細胞。

    使用較多的反應器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT?B反應器，使用雙槳葉無(wú)氣泡通氣攪拌系統；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統。兩種系統都能實(shí)現培養細胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。

二、微載體                                                                                

是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長(cháng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一種微載體問(wèn)世以來(lái)，國際市場(chǎng)上出售的微載體商品的類(lèi)型已經(jīng)達十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。

●微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內表面積（S/F）對細胞的生長(cháng)非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。
●微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著(zhù)細胞的貼附及生長(cháng)，密度可逐漸增大。
●微載體的表面電荷：據研究，控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過(guò)大，反而會(huì )產(chǎn)生“毒性”效應。

三、微載體培養原理與操作

1.原理：

其原理是將對細胞無(wú)害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著(zhù)生長(cháng)，同時(shí)通過(guò)持續攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。

貼壁依賴(lài)性細胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長(cháng)和擴展成單層三個(gè)階段。細胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(cháng)的關(guān)鍵。黏附主要是*靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

2. 攪拌轉速：

由于動(dòng)物細胞無(wú)細胞壁，對剪切力敏感，因而無(wú)法*提高攪拌轉速來(lái)增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉速，時(shí)攪時(shí)停；數小時(shí)后，待細胞附著(zhù)于微載體表面時(shí)，維持設定的低轉速，進(jìn)入培養階段。微載體培養的攪拌非常慢，最大速度75r/min。

3.細胞與微載體的相融性，是與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。

一般細胞在進(jìn)入生理PH值時(shí)，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁，但培養液中溶有或微載體表面吸附著(zhù)二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí)，則帶負電荷的細胞也能貼附。

4. 細胞在微載體表面的生長(cháng)

影響細胞在微載體表面生長(cháng)的因素很多，主要有三個(gè)方面。
●在細胞方面，如細胞群體、狀態(tài)和類(lèi)型。
●在微載體方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時(shí)細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。
●在培養環(huán)境中，如培養基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長(cháng)。如果所處條件最優(yōu)，則細胞生長(cháng)快；反之生長(cháng)速度慢。

5. 微載體培養操作要點(diǎn)

●培養初期：保證培養基與微球體處于穩定的PH與溫度水平，接種細胞（對數生長(cháng)期，而非穩定期）至終體積1/3的培養液中，以增加細胞與微載體接觸的機會(huì )。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。
●貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。
●培養維持期：進(jìn)行細胞計數（胞核計數）、葡萄糖測定及細胞形態(tài)鏡檢。隨意細胞增殖，微球變得越來(lái)越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過(guò)3d左右，培養液開(kāi)始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養液，緩慢加入新鮮培養液（37℃），重新開(kāi)始攪拌。
●收獲細胞：首先排干培養液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細胞及其產(chǎn)品。
●微載體培養的放大：可以通過(guò)增加微載體的含量或培養體積進(jìn)行放大。使用異倍體或原代細胞培養生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。

四、微載體大規模細胞培養的生物反應器系統

此技術(shù)大規模培養，細胞擴增的效率受到諸多因素的影響和限制，其中主要的限制性因素包括：細胞對剪切力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴大培養等。而研制的各種類(lèi)型生物反應器系統則可針對上述限制性因素，為微載體細胞培養與擴增提供低剪切力、高氧傳遞效率、易于細胞傳代等適宜的外部環(huán)境。已較多使用的微載體培養系統生物反應器，可以實(shí)行計算機控制操作，培養攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度變化、PH穩定及溶氧供應（O2、N2、CO2、空氣四種純化氣體按比例調節）、罐壓、培養體積和通氣量等參數全部由電腦自動(dòng)控制。因此，應用生物反應器系統進(jìn)行微載體細胞大規模擴增具有明顯優(yōu)勢，目前國外相繼研制了數種適合進(jìn)行微載體大規模細胞培養的生物反應器系統，如攪拌式生物反應器系統、旋轉式生物反應器系統以及灌注式生物反應器系統等。

1、攪拌式生物反應器系統

攪拌式生物反應器系統在微載體細胞大規模擴增研究領(lǐng)域已有較長(cháng)的研究歷史，但因該細胞培養系統容易產(chǎn)生過(guò)大的剪切力，從而限制了其應用范圍。盡管如此，由于該系統具有簡(jiǎn)單、實(shí)用及價(jià)格低廉等特點(diǎn)，國內外仍有不少應用該系統成功進(jìn)行細胞大規模擴增的研究報道。例如，Werner A（2000年）成功地在該系統內進(jìn)行了肝細胞大規模擴增的研究。

2、灌注式生物反應器系統

灌流培養是目前研究熱點(diǎn)之一。它的特點(diǎn)是不斷地加入新鮮培養基以及不斷地抽走含細胞代謝廢物的消耗培養基，使細胞得以在一個(gè)相對穩定的生長(cháng)環(huán)境內增殖，即省時(shí)省力，又減少了細胞發(fā)生污染的機會(huì )，且可以提高細胞密度10倍以上。

3、旋轉生物反應器

近年來(lái)，旋轉生物反應器系統（RCCS）已經(jīng)成為應用微載體技術(shù)進(jìn)行細胞大規模擴增的一種較常用細胞培養系統。該系統是基于美國航空航天局為模擬空間微重力效應而設計的一種生物反應器。RCCS既可以用于微載體大規模細胞培養，又能在其內培育細胞與支架形成的三維空間復合體。至今，近百種組織細胞均在該系統內成功進(jìn)行了大規模擴增。

五、微載體培養優(yōu)點(diǎn)

●表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養液的細胞產(chǎn)率高；
●把懸浮培養和貼壁培養融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；
●可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀(guān)察細胞在微珠表面的生長(cháng)情況；
●簡(jiǎn)化了細胞生長(cháng)各種環(huán)境因素的檢測和控制，重現性好；
●培養基利用率較高；
●放大容易；
●細胞收獲過(guò)程不復雜；
●勞動(dòng)強度??；
●培養系統占地面積和空間小。