| 菌株簡(jiǎn)介 |
DUALmembrane系統是DUALsystems BioTech公司開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測技術(shù)，它利用分離的泛素系統（split-ubiquitin）直接檢測天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用，是目前市面上唯一檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統。此系統采用NMY51酵母菌株，可直接轉化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白互作驗證或篩庫試驗；此菌株Transformation marker為: trp1, leu2-3，報告基因為：HIS3, ADE2 和 lacZ，第一步通過(guò)營(yíng)養缺陷型報告基因（HIS3, ADE2）進(jìn)行選擇性生長(cháng)篩選，進(jìn)一步通過(guò) LacZ 報告基因進(jìn)行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個(gè)獨立的報告基因，受不同啟動(dòng)子的調控，降低假陽(yáng)性幾率。原理：泛素（ubiquitin）分子量很小，由 76aa 殘基組成；泛素作為降解信號分子，可以連接另外一種蛋白質(zhì)的 N 端，然后被泛素專(zhuān)一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分：N 端（Nub），C 端（Cub）。首先，人為地將泛素 Nub 的 3 位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔∟ubI 突變?yōu)?NubG）。這樣與 Cub 的親合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我結合或接近的可能性。其次，將Cub 部分與人工合成的 LexA-VP16 轉錄激活因子融合成一個(gè)融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下 NubG不與Cub 結合，UBPs 也不能識別分離的泛素，轉錄激活因子也不會(huì )被切下來(lái)。最后，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與NubG和Cub融合，形成 bait 融合蛋（bait-cub-LexA -VP16）和 prey 融合蛋白（prey-NubG）。如果 bait 和 prey發(fā)生相互作用，就會(huì )促使 NubG 和 Cub 的相互接近，被 UBPs 識別，導致 LexA-VP16 的解離，進(jìn)入核內，從而激活報告基因的轉錄。 此系統可使用四種Bait質(zhì)粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標志均為L(cháng)EU；三種Prey質(zhì)粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標志均為T(mén)RP。NMY51酵母菌株可用YPDA在28℃有氧的條件下培養，然后使用30%的甘油保藏菌種。 |
