腫瘤細胞在組織培養中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類(lèi)是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細胞培養對闡明和解決癌癥將起著(zhù)不可估量的作用。

一、  組織培養腫瘤細胞生物學(xué)特性

腫瘤細胞與體內正常細胞相比，不論在體內或在體外，在形態(tài)、生長(cháng)增值、遺傳性狀等方面都有顯著(zhù)的不同。生長(cháng)在體內的腫瘤細胞和在體外培養的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養中的腫瘤細胞具以下突出特點(diǎn)：

（－）形態(tài)和性狀
    培養中癌細胞無(wú)光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數腫瘤細胞鏡下觀(guān)察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀(guān)察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動(dòng)和錨著(zhù)不依賴(lài)性有關(guān)。

（二）生長(cháng)增殖
    腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性，在體外培養中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長(cháng)的因子，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長(cháng)。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細胞發(fā)生轉化后，出現能在低血清培養基中生長(cháng)的現象，已成為檢測細胞惡變的一個(gè)指標。癌細胞或培養中發(fā)生惡性轉化后的單個(gè)細胞培養時(shí)，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜毎麖?。另外癌細胞增殖數量增多擴展時(shí)，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。

（三）永生性
    永生性也稱(chēng)不死性。在體外培養中表現為細胞可無(wú)限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀，體內腫瘤細胞是否如此尚無(wú)直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內時(shí)同樣如此？也尚難肯定。從近年建立細胞系或株的過(guò)程說(shuō)明，如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的，腫瘤細胞應易于培養。事實(shí)上，多數腫瘤細胞初代培養時(shí)并不那么容易。生長(cháng)增殖并不旺盛；經(jīng)過(guò)純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現類(lèi)似二倍體細胞培養中的停滯期。過(guò)此階段后才獲得永生性，順利傳代生長(cháng)下去。從而說(shuō)明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養后獲得的。從一些具有永生性而無(wú)惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調控，但卻有相關(guān)性?？赡苡郎允羌毎麗鹤兊碾A段。至少在體外是如此。

（四）浸潤性
    浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養時(shí)，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長(cháng)的能力。

（五）異質(zhì)性
    所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。異質(zhì)性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區的細胞獲得血液供應多，增殖旺盛，中心區有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱(chēng)干細胞（Stem Cells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長(cháng)的成分。腫瘤干細胞培養時(shí)易于生長(cháng)增殖；把干細胞分離出來(lái)的培養方法稱(chēng)干細胞培養。

（六）細胞遺傳
    大多數腫瘤細胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個(gè)細胞群組成，有干細胞系和數個(gè)亞系，并不斷進(jìn)行著(zhù)適應性演變。

（七）其它
腫瘤細胞在體外不易生長(cháng)的原因可能由于：
①依賴(lài)性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長(cháng)力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質(zhì)成纖維細胞的依賴(lài)。體外分散培養和排除成纖維細胞后也會(huì )同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細胞增殖生長(cháng)的活性；
②腫瘤細胞的自泌也會(huì )因分散培養而被稀釋?zhuān)_不到腫瘤生長(cháng)的需求，降低腫瘤細胞的生長(cháng)增殖力；
③并非所有腫瘤細胞都有強的生長(cháng)活力和長(cháng)的Life Span，只有干細胞才有強的增殖生長(cháng)能力，但這些細胞數量很少；
④離體培養腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件。

二、培養方法

腫瘤細胞培養成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個(gè)方面。在具體培養方法方面，腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養并無(wú)原則差別，初代培養應用組織塊和消化培養法均可。

1．取材：

人腫瘤細胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養，如因故不能立即培養，可貯存于4℃中，但不宜栽過(guò)24小時(shí)。

2．培養基：

腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養不加血清不能生長(cháng)，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長(cháng)。腫瘤細胞對培養環(huán)境適應性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長(cháng)物質(zhì)之故。但這并不說(shuō)明腫瘤細胞完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長(cháng)因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長(cháng)因子的需求都存在著(zhù)差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長(cháng)因子。有的還需特異性生長(cháng)因子〔如乳腺癌細胞等）?？傊囵B腫瘤細胞仍需加血清和相關(guān)生長(cháng)因子培養更易成功。

3．成纖維細胞的排除：

成纖維細胞常與腫瘤細胞同時(shí)混雜生長(cháng)，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長(cháng)得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長(cháng)。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關(guān)鍵。排除成纖維細胞有多種方法（表2－1）。

表2－1 抑制成纖維細胞生長(cháng)因素

注：上表結果為個(gè)別實(shí)驗室經(jīng)驗，僅供參考

三、成纖維細胞排除法

1．機械刮除法：

是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：
（1）標記：鏡下觀(guān)察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長(cháng)腫瘤細胞的部位；
（2）刮除：棄掉培養液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標記空間；
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；
（4）注入培養液繼續培養，如發(fā)現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止

1．         反復貼壁法：

根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結合使用不加血清的營(yíng)養液，把含有兩類(lèi)細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類(lèi)細胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細胞生長(cháng)達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；
（2）取編號為此A、B、C三個(gè)培養瓶；首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養5～20分鐘后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種入B培養瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；
（3）培養B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養液注入C培養瓶中；再向B瓶中補加完全培養基。

當三個(gè)瓶?jì)榷己信囵B液后，均在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀(guān)察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細胞，B瓶?jì)深?lèi)細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時(shí)可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。

2．         消化排除法：

此法曾用于乳癌細胞的培養，具體程序是：

（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養細胞一次，然后再換成新的混合液繼續消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養瓶，到半數細胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養液置溫箱中培養；向原瓶?jì)纫惭a加新的培養液繼續培養。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經(jīng)過(guò)幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。

4．膠原酶消化法：

本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發(fā)現成纖維細胞被除掉后，即終止消化；
（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養液，繼續培養，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。

3．         其它方法：

有人發(fā)現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長(cháng)的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞，再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養。最近也有人應用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細胞生長(cháng)的方法。

    選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗，取得必要經(jīng)驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。

四、提高腫瘤細胞培養存活率和生長(cháng)率措施

根據人們的經(jīng)驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養后，常出現以下幾種情況：

完全無(wú)細胞游出或移動(dòng)；
    有細胞移動(dòng)和游出，但無(wú)細胞增殖，細胞長(cháng)時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代；
    有細胞增殖，傳若干代后停止生長(cháng)或衰退死亡；
    傳數代后細胞增殖緩慢，經(jīng)過(guò)一段停滯期后，才又呈旺盛生長(cháng)狀態(tài)，形成穩定生長(cháng)的腫瘤傳代細胞系。

以上現象說(shuō)明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過(guò)對新環(huán)境的適應才能生長(cháng)，因此欲獲得好的培養效果，不能局限于一般培養法，必須采用一些特殊的措施。

1．適宜底物：把經(jīng)過(guò)純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。

2．生長(cháng)因子：應用促細胞生長(cháng)因子，向培養液中增加一種或幾種促細胞生長(cháng)因子。根據細胞種類(lèi)不同選用不同的促生長(cháng)物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長(cháng)因子。

為提高腫瘤細胞對體外培養環(huán)境的適應力和增加有活力癌細胞（干細胞）的數量，可采用動(dòng)物體轉嫁接種成瘤后，再從動(dòng)物體內取出進(jìn)行培養，能提高體外培養的成功率。受體動(dòng)物以裸鼠最好。

3.動(dòng)物體媒介培養方法：

（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動(dòng)物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊；
（2）飼養觀(guān)察，待腫瘤生長(cháng)達較大體積后，剝取出瘤組織；
（3）進(jìn)行體外培養。
（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過(guò)裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數量增多，細胞培養易于成功。

腫瘤細胞培養方法與培養正常細胞完全相同，但成功率比正常細胞高。

五、體外培養腫瘤細胞生物學(xué)檢測

一旦培養的腫瘤細胞生長(cháng)成形態(tài)上單一的細胞群體或細胞系（或株）后，不論用于實(shí)驗研究還是建立細胞系，都需要做一系列的細胞生物學(xué)測定，主要的目的在于求得證明：

所培養的細胞系的確來(lái)源于原體內具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測定項目數量無(wú)明確規定，根據需要而定，以下為常做的項目和要點(diǎn)。

【形態(tài)觀(guān)察】主要觀(guān)察細胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。
【細胞生長(cháng)增殖】檢測細胞生長(cháng)曲線(xiàn)、細胞分裂指數、倍增時(shí)間、細胞周期時(shí)間。
【細胞核型分析】檢測核型特點(diǎn)，染色體數量、標記染色體的有無(wú)、帶型等。
【凝集試驗】檢測凝集力。
【軟瓊脂培養】檢測集落形成能力。
【異體動(dòng)物接種】向異體動(dòng)物體內（皮下）接種細胞懸液，觀(guān)察成瘤能力。
【其它】除上述項目外，根據需要還可做同位素標記、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀(guān)察等。

在上述腫瘤細胞生物學(xué)檢測中，最主要的為：異體動(dòng)物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養、核型分析、細胞骨架和電鏡觀(guān)察等幾項。當然從分子細胞學(xué)角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測，這些項目將在本書(shū)第二篇中介紹。

六、對腫瘤細胞系或細胞株的評價(jià)

已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株，無(wú)疑都是可用的實(shí)驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多，并獲得越來(lái)越廣泛的應用。但根據研究者的經(jīng)驗，在使用這些細胞系時(shí)，應持特別審慎態(tài)度，主要是應考慮到這些細胞在長(cháng)期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知，長(cháng)期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動(dòng)。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時(shí)的性狀仍是一致的。

    已如前述，癌細胞在培養中并非能很順利地傳下去，凡已長(cháng)期傳代的細胞系，都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性；因此尚難肯定在長(cháng)期培養中的癌細胞的生物學(xué)性狀與體內時(shí)仍完全相同（包括不死性）。據上述對用癌細胞系所獲實(shí)驗結果應盡量做分析性的結論，避免做概括性的與體內等同的結論，外推與體內等同更是不妥的。廣泛來(lái)說(shuō)，應用各種較長(cháng)時(shí)間培養細胞做實(shí)驗時(shí)，都應如此.