一、  從原代組織中分離細胞

將組織塊分離（散）成細胞懸液的方法有多種，最常用的是機械解離細胞法、酶學(xué)解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。 從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短，以保持最大的活性。下列步驟可以解聚整個(gè)組織，獲得較高產(chǎn)量的有活性細胞。

1.胰蛋白酶 (Trypsin)

●在去除不需要的組織后，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2到3次。
●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。
●在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒(méi)有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。
●移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。
●在組織碎片加入熱的完全培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
●通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200mm）過(guò)濾，分散所有剩余組織。計數和接種細胞，進(jìn)行培養。

2.膠原酶 (Collagenase)

●用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。
●加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。
●在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。
●通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。
●通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次。
●再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進(jìn)行培養。

3. 分散酶（Dispase）中性蛋白酶[用于分散組織培養中的動(dòng)物細胞]

●用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。
●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液）
●在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。
●通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。
●通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。
●再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進(jìn)行培養。 二、從原培養容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞，且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著(zhù)對于所有細胞系的廣泛應用，每一種系統最佳條件和施用濃度應該根據經(jīng)驗加以確定。
●再次培養時(shí)檢測細胞的活性。
●細胞的活率應該超過(guò)90％
●對于無(wú)血清培養基，降低胰蛋白酶使用量。

1. 移棄使用過(guò)的細胞培養基。

2. 使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞（看表確定正確的清洗溶液）。在培養瓶對著(zhù)細胞的一面加入清洗溶液，通過(guò)轉動(dòng)培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。

3. 以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見(jiàn)表)到培養瓶對著(zhù)細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養瓶，輕輕搖動(dòng)培養瓶。通常，在5到15分鐘內，細胞就會(huì )脫落。細胞分離需要的時(shí)間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過(guò)程，避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過(guò)程。

4. 當細胞完全分離時(shí)，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入完全培養基，通過(guò)移液管在單層細胞表面反復吹打來(lái)分散細胞。計數并再次培養細胞。

5. 對于無(wú)血清培養基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。