體內組織細胞在體外培養時(shí)，所需培養環(huán)境基本相似，但由于物種、個(gè)體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養技術(shù)措施亦不盡相同，現介紹個(gè)別組織細胞培養的要點(diǎn)如下:
第一節 上皮細胞培養
上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中?；祀s有成纖維細胞，培養時(shí)生長(cháng)速度往往超過(guò)上皮細胞，并難以純化，同時(shí)上皮細胞難以在體外長(cháng)期生存，因此純化和延長(cháng)生存時(shí)間是培養關(guān)鍵。
體內上皮細胞生長(cháng)在膠原構成的基膜，因此培養在有膠原的底物上可能利于生長(cháng)，另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層（用射線(xiàn)照射后）時(shí)，細胞易生長(cháng)并可發(fā)生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加入表皮生長(cháng)因子，均有利于表皮細胞生長(cháng)。
以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）
1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。
2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。
3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過(guò)夜。
4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開(kāi)。
5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。
6、反復吹打，制成懸液。
7、培養：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸去上清。
8、直接加入培養基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2溫箱培養。
第二節 內皮細胞培養
內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞，對于研究?jì)绕ぜ毎偕?、腫瘤促血管生長(cháng)因子（TAF）等有很大價(jià)值。
研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡(jiǎn)便，其法如下：
1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無(wú)菌剪取10—15厘米長(cháng)一段，如不能立即培養，可于12小時(shí)內保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線(xiàn)繩扎緊，以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿(mǎn)血管，消化3—10分鐘；注入口用線(xiàn)繩扎，以防液體返流。
4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復）。
5、離心去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫箱培養。兩至三天可見(jiàn)細胞長(cháng)成單層。
第三節 神經(jīng)細胞培養
神經(jīng)細胞（神經(jīng)元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長(cháng)因子和膠質(zhì)細胞因子時(shí)，可出現一定程度的分化，長(cháng)出突起等現象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養的成分。
人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養，不僅能獲得生長(cháng)的膠質(zhì)細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細胞在培養中生長(cháng)不穩定，不易自發(fā)轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉化。
一． 設備： 無(wú)菌操作設備。
二． 大型設備CO2培養箱：恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。
倒置顯微鏡：用于每天觀(guān)察貼壁細胞生長(cháng)情況。
解剖顯微鏡，用于準確地取材。
常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。
低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。
電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。
高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術(shù)器械。
過(guò)濾器：配制解剖液、培養液，必須過(guò)濾后才可使用，以去除細菌。
滲透壓儀，pH劑，天平等。
三． 培養器皿及手術(shù)器械
1 培養皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。
2 培養板，24-40孔，可用于開(kāi)放培養。
3 培養瓶：
4 吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。
5 各類(lèi)培養液貯存器。
6 小型手術(shù)器械。
準備：
一 配制培養液
（1） 解剖液：以無(wú)機鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。
（2） 基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。
（3） 接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。
（4） 維持培養液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營(yíng)養物質(zhì)。
二 培養基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴(lài)氨酸，再涂膠
三 消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前1天進(jìn)行。
神經(jīng)細胞分散培養
（一） 選材 常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過(guò)也有認為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。
（二） 取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。
（三） 細胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。
（四） 抑制膠質(zhì)細胞生長(cháng)。培養3-5d后，也有人認為培養7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長(cháng)。
（五） 觀(guān)察。接種6-12h，開(kāi)始貼壁，并有集合現象，細胞生長(cháng)突起明顯，5-7d膠質(zhì)細胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細胞成片于神經(jīng)細胞下面，形成地毯，2周時(shí)神經(jīng)細胞生長(cháng)最豐滿(mǎn)，四周暈光明顯，一個(gè)月后，有些神經(jīng)細胞開(kāi)始退化，變形，甚至出現空泡，一般培養2-4周最宜。
但神經(jīng)細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會(huì )有細胞周期，而且隨培養時(shí)間的延長(cháng)，細胞數量在下降，但膠質(zhì)細胞可以，神經(jīng)膠質(zhì)細胞也可以。在培養過(guò)程中，早期9-12d時(shí)，有較多的神經(jīng)細胞死亡，這是第一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長(cháng)而多，且相互形成突觸。
（六） 常用培養細胞實(shí)驗有：FCM的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析；免疫組化分析；
但免疫組化分析應注意，由于抗體直接作用于活細胞，不易穿透活細胞，故對核內抗原定位時(shí)，首先考慮膜對抗體的通透性問(wèn)題。常用化學(xué)試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。
在免疫組化中，或其它組織學(xué)染色中，常用不同的染色方法以區分不同細胞，如半乳糖腦苷脂對小樹(shù)突膠質(zhì)細胞標記明顯；GFAP對星形膠質(zhì)細胞具有特異性染色等。這對研究神經(jīng)系統中膠質(zhì)細胞功能具有極大的應用價(jià)值。神經(jīng)膠質(zhì)細胞以往多被忽視，其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷）、退行性疾?。ㄈ?span lang="EN-US">AD、PD）、損傷后膠質(zhì)細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細胞功能和營(yíng)養支持的物質(zhì)基礎。
第四節 肌組織細胞培養
各種肌組織均可用于培養，以心肌和骨骼肌較實(shí)用。
（－）骨骼肌細胞培養
1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。
2、無(wú)菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)。
3、計數調整細胞密度。
4、快接種量2×106/皿入培養基培養。
5、培養基內含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。
接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。
該細胞接種率約50%，細胞生長(cháng)開(kāi)始呈紡錘形，培養50－52小時(shí)后出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時(shí)可觀(guān)察到橫紋，一般在融合后二、三天內能見(jiàn)到收縮現象。
（二）心肌細胞培養
心肌細胞是最早的培養材料，Carrel曾長(cháng)期培養過(guò)心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養物，最常用的是雞胚心肌。
心肌比較容易培養和生長(cháng)，可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法，均可獲良好的效果。取心室肌培養較好，原代培養的雞胚心肌呈紡錘形，培養成功時(shí)，一周后可見(jiàn)節律性收縮現象。
第五節 巨噬細胞培養
巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進(jìn)行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長(cháng)期生存。
巨噬細胞也建有無(wú)限細胞系，大多來(lái)自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。
培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來(lái)源來(lái)獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用，其法如下：
1、實(shí)驗前三天，向小鼠腹腔內注入無(wú)菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內?。?，以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細胞。
2、引頸處死小鼠。
3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。
4、置動(dòng)物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開(kāi)腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時(shí)用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動(dòng)。
6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。
7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。
8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養基。
9、計數細胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。
10、以3×105個(gè)貼附細胞/平方厘米接種。
11、接種數小時(shí)后，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養液置CO2溫箱中。
第六節 腎小球分離、移植培養
SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺內，打開(kāi)腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank's液的無(wú)菌培養皿洗滌，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過(guò)篩網(wǎng)，濾過(guò)組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過(guò)，去小組織塊，濾過(guò)物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過(guò)，Hank's液洗滌1次，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀(guān)察為分離良好的腎小球。
腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應，離心除去膠原酶。處理過(guò)的腎小球計數后接種至24孔培養板或25ml培養瓶，使腎小球大于60個(gè)/cm2，加培養基5～10ml（培養基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的松；5μg/ml轉鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養8～10天，去除腎小球未生長(cháng)組分，細胞繼續培養24小時(shí)，形態(tài)學(xué)觀(guān)察：細胞生長(cháng)成單層多角型細胞，直徑約100μm。
第七節 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養
無(wú)菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時(shí)，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過(guò)程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個(gè)注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細胞）來(lái)回推動(dòng)注射器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上。
常規方法接種培養收獲細胞。
