現代生物技術(shù)均通過(guò)細胞作為載體來(lái)進(jìn)行，無(wú)論是基因治療、干細胞、克隆技術(shù)都在細胞內進(jìn)行的。細胞的生長(cháng)需要一定的營(yíng)養環(huán)境，用于維持細胞生長(cháng)的營(yíng)養基質(zhì)稱(chēng)為培養基，即指所有用于各種目的的體外培養、保存細胞用的物質(zhì)，就其本意上講為人工模擬體內生長(cháng)的營(yíng)養環(huán)境，使細胞在此環(huán)境中有生長(cháng)和繁殖的能力。它是提供細胞營(yíng)養和促進(jìn)細胞生長(cháng)增殖的物質(zhì)基礎。細胞培養基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機離子及其他一些入核酸降解物、激素等。
隨著(zhù)動(dòng)物細胞大規模培養技術(shù)的迅速發(fā)展，作為細胞培養領(lǐng)域中最基本的原料－細胞培養基的用量也迅速增加，被廣泛應用于細胞生物學(xué)科和醫學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如疫苗生產(chǎn)（人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產(chǎn)（如EPO、TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。
第一節 水與平衡鹽溶液
1.培養用水:體外培養的細胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要求較高。培養用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時(shí)也會(huì )影響細胞的存活和生長(cháng)，甚至導致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會(huì )含有某些金屬離子，一般不作為培養用水。配制培養用液應使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。最好用龍頭瓶貯存，存放時(shí)間一般不應超過(guò)2周。
2.緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。
第二節 細胞培養基的基本要求
體外培養的細胞直接生活在培養基中，因此培養基應能滿(mǎn)足細胞對營(yíng)養成分、促生長(cháng)因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。
一、營(yíng)養成分 維持細胞生長(cháng)的營(yíng)養條件一般包括以下幾個(gè)方面：
1.氨基酸：是細胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴(lài)、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過(guò)程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來(lái)源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。 體外培養的各種培養基內都含有必需氨基酸。
2.單糖：培養中的細胞可以進(jìn)行有氧與無(wú)氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。
體外培養動(dòng)物細胞時(shí)，幾乎所有的培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
3.維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養基常有的成分。
4.無(wú)機離子與微量元素：細胞生長(cháng)除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。
二、促生長(cháng)因子及激素 已證實(shí)：各種激素、生長(cháng)因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長(cháng)有促生長(cháng)作用，如胰島素，它能促進(jìn)細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類(lèi)細胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細胞的生長(cháng)，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細胞生長(cháng)作用等。
三、滲透壓 細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數哺乳動(dòng)物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。
四、pH 氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長(cháng)、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數細胞缺氧不能生存。在開(kāi)放培養時(shí)，一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養基的pH有直接關(guān)系。動(dòng)物細胞大多數需要輕微的堿性條件，pH值約在7．2~7．4℃在細胞生長(cháng)過(guò)程中，隨細胞數量的增多和代謝活動(dòng)的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩定，致使緩沖系統難以精確地控制。故這一緩沖系統適合密閉培養。HEPES結合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動(dòng)，但最大缺點(diǎn)是在開(kāi)放培養或觀(guān)察時(shí)難以維持正常的pH值。造成pH波動(dòng)主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養過(guò)程中CO2與水結合產(chǎn)生碳酸，培養基pH很快下降。為解決這一問(wèn)題，合成培養基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統，并采用開(kāi)放培養，使細胞代謝產(chǎn)生的CO2及時(shí)溢出培養瓶，再通過(guò)穩定調節溫箱中CO2濃度（5％），與培養基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。
五、無(wú)毒、無(wú)污染 體外生長(cháng)的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒(méi)有抵抗能力，因此培養基應達到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無(wú)其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）。對于天然培養基，污染主要來(lái)源于取材過(guò)程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養基，污染主要來(lái)源于配制過(guò)程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過(guò)濾除菌。
第三節 天然細胞培養基
天然培養基是指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類(lèi)培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術(shù)建立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由于天然培養基制作過(guò)程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養基所替代。目前廣泛使用的天然培養基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細胞貼壁的膠原類(lèi)物質(zhì)在培養某些特殊細胞也是必不可少。
一、血清(serum)細胞培養的發(fā)展，培養基的質(zhì)量又是關(guān)鍵，而培養基的主要成份中動(dòng)物血清對細胞的生長(cháng)繁殖發(fā)揮著(zhù)重要甚至是難以替代的作用。在動(dòng)物血清的應用中牛血清又是最為廣泛的，所以血清是醫藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證血清質(zhì)量也是促進(jìn)生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節。
1.血清種類(lèi):目前用于組織培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因：來(lái)源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過(guò)長(cháng)時(shí)間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數哺乳動(dòng)物細胞都是適合的，但并不排除在培養某種細胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適。
牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有豐富的細胞生長(cháng)必須的營(yíng)養成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。
2.血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動(dòng)物的性別、年齡、生理條件和營(yíng)養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(cháng)因子、激素、無(wú)機物等，這些物質(zhì)對促進(jìn)細胞生長(cháng)或抑制生長(cháng)活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題。主要是：
第一:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類(lèi)生長(cháng)因子、激素和脂類(lèi)等尚未充分認識，這給研究工作帶來(lái)許多困難；
第二:血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗的標準化和連續性受到限制；
第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。
3.血清主要作用：
●提供基本營(yíng)養物質(zhì)：氨基酸、維生素、無(wú)機物、脂類(lèi)物質(zhì)、核酸衍生物等，是細胞生長(cháng)必須的物質(zhì)。
●提供激素和各種生長(cháng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類(lèi)固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(cháng)因子如成纖維細胞生長(cháng)因子、表皮生長(cháng)因子、血小板生長(cháng)因子等。
●提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過(guò)程中起重要作用。
●提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。
●對培養中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現的，現在則有目的的使用血清來(lái)終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養攪拌時(shí)，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。
4.細胞培養中使用血清的缺點(diǎn)
血清成分復雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個(gè)明顯的缺點(diǎn)：
●對大多數細胞，在體內狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過(guò)程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細胞的生長(cháng)（成纖維細胞）同時(shí)抑制另一類(lèi)細胞生長(cháng)（表皮細胞）。
●血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來(lái)自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會(huì )影響細胞生長(cháng)，甚至造成細胞死亡。
●動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。
●取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，可能導致實(shí)驗失敗或實(shí)驗結果不可靠性。
●血清的使用使得實(shí)驗和生產(chǎn)的標準化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。
●大規模生產(chǎn)中，血清來(lái)源越來(lái)越困難，價(jià)格昂貴，是構成動(dòng)物細胞培養對生產(chǎn)成本的主要部分之一。
5.血清的質(zhì)量標準:血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過(guò)程。用于取材的動(dòng)物應健康無(wú)病并且在指定的出生天數之內，取材過(guò)程應嚴格按照操作規程執行，制備出的血清要經(jīng)過(guò)嚴格的質(zhì)量鑒定。WHO公布的《用動(dòng)物細胞體外培養生產(chǎn)生物制品規程》中的要求：
▲牛血清必須來(lái)自有文件證明無(wú)牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監測系統。
▲有些國家還要求牛血清來(lái)自未用過(guò)反芻動(dòng)物蛋白飼料的牛群。
▲證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。
▲血清要通過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，保證無(wú)菌。
▲無(wú)細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無(wú)細菌噬菌體污染。
▲對細胞有良好的支持繁殖作用。
我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質(zhì)含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。
血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個(gè)方面：
●理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。
●微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過(guò)孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺(jué)，細胞也能生長(cháng)繁殖，但會(huì )影響實(shí)驗結果。檢測支原體的方法很多，如培養法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀(guān)察法等。
●促生長(cháng)效果：這是血清重要的特性之一，應當以培養的細胞來(lái)檢測。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續傳代培養法。
(1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長(cháng)的細胞為培養對象，按有限稀釋法做克隆化培養，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養一定時(shí)間，統計有克隆生長(cháng)的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區別。比較低的濃度，更能觀(guān)察出血清質(zhì)量間的細微差別。
(2)貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個(gè)細胞，以不同濃度的血清培養基培養，培養一定時(shí)間后棄培養基，染色后統計集落數，計算出集落數占接種細胞數的百分比，同樣再與標準血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。
(3)連續傳代培養法:是將細胞培養于3個(gè)一定體積的培養瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細胞，計數，取平均值，中間可以更換一次培養基。連續測試三個(gè)周期以上，觀(guān)察細胞生長(cháng)狀況，并將每次的計數結果與標準血清的測試結果比較。
●對于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀(guān)入手。好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無(wú)沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說(shuō)明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說(shuō)明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現象；如果搖晃時(shí)感覺(jué)液體稀薄，說(shuō)明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量，則應連續培養某些細胞，觀(guān)察細胞生長(cháng)狀況。
6.血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應有的作用。
●使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過(guò)滅活也會(huì )損失一些對細胞有利的成分，如生長(cháng)因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細胞培養。
●儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時(shí)應避免反復凍融。購買(mǎi)大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時(shí)最好現置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長(cháng)時(shí)間存放，應盡快使用。
●使用濃度：自從有了合成培養基，血清就是作為一種添加成分與合成培養基混合使用，使用濃度一般為5－20％，最常用是10％。過(guò)多血清容易使培養中的細胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無(wú)限細胞系，迅速生長(cháng)之后容易發(fā)生惡性轉化。
●采購血清時(shí)，最好先從供應商處索取樣品進(jìn)行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個(gè)月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過(guò)預先試驗的樣品代替。
二、胚胎浸出液
胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動(dòng)物細胞培養中應用的天然培養基，現已很少使用。
三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養基，可用于許多細胞和原代細胞的培養。
第四節 合成細胞培養基
合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設計、配制的培養基。它有一定的配方，是一種理想的培養基。目前合成培養基多達10多余種，有的培養基仍在不斷進(jìn)行改良。早期組織培養是利用天然培養基，目前合成培養基已經(jīng)成為一種標準化的商品，從最初的基本培養基發(fā)展到無(wú)血清培養基、無(wú)蛋白培養基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養基的出現極大的促進(jìn)了組織培養技術(shù)的普及發(fā)展。
一、基本組分 基本培養基包括四大類(lèi)物質(zhì)：無(wú)機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。
●無(wú)機鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對調節細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。
●氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴(lài)、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類(lèi)轉化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細胞的培養特別重要，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來(lái)源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長(cháng)不良甚至死亡。在配制各種培養液中都應補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養液中。
●維生素：是維持細胞生長(cháng)的一種生物活性物質(zhì)，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。
●碳水化合物：是細胞生命的能量來(lái)源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養動(dòng)物細胞時(shí)，幾乎所有培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
●葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的產(chǎn)物。研究表明，體外培養條件下95％的葡萄糖轉變?yōu)槿樗?，這降低了營(yíng)養物質(zhì)的代謝效率，降低培養基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉運系統蘋(píng)果酸－天冬氨酸穿梭系統活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進(jìn)行。另一個(gè)可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過(guò)量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)最常用的方法是限制培養基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過(guò)低可造成細胞營(yíng)養供應不足，細胞生長(cháng)抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達量等參數進(jìn)行綜合考慮方可應用。
在目前常用的培養基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養動(dòng)物細胞的主要能源，其能量代謝通路與體內完全不同，表現為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過(guò)不完全氧化途徑，另一小部分通過(guò)完全氧化為細胞供能。因此，適當的調整細胞內的代謝途徑，使之能促進(jìn)細胞的快速生長(cháng)和產(chǎn)物合成，同時(shí)減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。
許多動(dòng)物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對營(yíng)養物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細胞生長(cháng)而言，二者的快速利用并非細胞必需；相反相當一部分轉化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細胞生長(cháng)以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規模細胞培養技術(shù)研究的重要方向。
氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。
●除了以上與細胞生長(cháng)有關(guān)的物質(zhì)以外，培養基中一般還要加入酚紅（當溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色；當溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。
●在較為復雜的培養液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類(lèi))以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。
二、常用細胞培養基
(1).MEM細胞培養基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(2).DMEM細胞培養基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(3)RPMI-1640細胞培養基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(4).199細胞培養基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(5).水解乳蛋白細胞培養基（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(6)歐氏平衡鹽（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(7)F-10,F-12細胞培養基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(8)其它類(lèi)型細胞培養基
三、干粉培養基的配制
配制培養基要注意以下問(wèn)題：
●認真閱讀說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)都注明干粉不包含的成分，常見(jiàn)的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據實(shí)驗需要決定。
●配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養基完全溶解之后才能添加。
●配制所用的水應是三蒸水，離子濃度很低。
●所用器皿應嚴格消毒。
●配制好的培養基應馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于4度。
●液體培養基主要是為了科研工作的方便而設計的培養基，它是一種滅菌后保證無(wú)菌的溶液，必要時(shí)可制成無(wú)內毒素等的溶液，可節省科研人員的工作量。
配制方法
●在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預期培養基總體積少5％的雙蒸水。
●在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養基，輕輕攪拌，不要加熱。
●水洗包裝袋的內部，轉移全部的痕量干粉到容器內。
●加NaHCO3到培養基中。
●用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過(guò)分攪拌。
●通過(guò)緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調節pH值，由于pH值在過(guò)濾時(shí)會(huì )上升0.1到0.3，因 而調節pH值使它比最終想要的pH值低0.2到0.3。培養基在過(guò)濾前要保持密封。
第五節 無(wú)血清技術(shù)及其培養基
經(jīng)歷了天然培養基、合成培養基后，無(wú)血清培養基和無(wú)血清培養成為當今細胞培養領(lǐng)域的一大趨勢。采用無(wú)血清培養可降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。
無(wú)血清培養基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長(cháng)時(shí)間生長(cháng)繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配制的完全培養基可以滿(mǎn)足大部分細胞培養的要求，但對有些實(shí)驗卻不適合，如觀(guān)察一種生長(cháng)因子對某種細胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(cháng)因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(cháng)因子；又如需要測定某種細胞在培養過(guò)程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(cháng)因子）的能力；或者要大規模的培養某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無(wú)血清培養基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標。上海恒利安生物科技有限公司已成功開(kāi)發(fā)了商業(yè)化的多種無(wú)血清培養基，可滿(mǎn)足眾多廠(chǎng)商的需求。
一、無(wú)血清培養基的基本配方:基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。
用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細胞在體外培養時(shí)，多數呈貼壁生長(cháng)或兼性貼壁生長(cháng)；而當其在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養基中生長(cháng)時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長(cháng)。
添加組分包括以下幾大類(lèi)物質(zhì)：
(1）促貼壁物質(zhì)：許多細胞必須貼壁才能生長(cháng)，這種情況下無(wú)血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著(zhù)重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、CHO細胞、成肌細胞等。
(2）促生長(cháng)因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長(cháng)因子。激素也是刺激細胞生長(cháng)、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。
(3）酶抑制劑：培養貼壁生長(cháng)的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無(wú)血清培養基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。
(4）結合蛋白和轉運蛋白：常見(jiàn)如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無(wú)血清培養基都含有牛血清白蛋白。
(5)微量元素：硒是最常見(jiàn)的。
二、使用方法:目前，血清仍是動(dòng)物細胞培養中最基本的的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長(cháng)狀況不良時(shí)，常常會(huì )先使用有血清的培養液進(jìn)行培養，待細胞生長(cháng)旺盛以后，再換成無(wú)血清培養液。細胞轉入無(wú)血清培養基培養要有一個(gè)適應過(guò)程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無(wú)血清培養。在降低過(guò)程中要注意觀(guān)察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗后這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長(cháng)期培養于無(wú)血清培養基而不發(fā)生改變的。細胞轉入無(wú)血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養于含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。
為了使細胞適應無(wú)血清培養，關(guān)鍵的是使所培養細胞：
●處于對數生長(cháng)中期
●>90% 活細胞率
●適應時(shí)以較高的起始細胞接種
有兩種方法使細胞適應無(wú)血清培養基（SFM）:
1. 直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無(wú)血清培養基（SFM）中。
一些類(lèi)型細胞可直接從包含血清的培養基適應無(wú)血清培養基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時(shí)，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4到7天后達到2×106~4×106細胞/ml時(shí)，細胞完全適應了無(wú)血清培養基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml，細胞活率在90％時(shí)，貯備的適應了無(wú)血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。
2. 連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無(wú)血清培養基（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。
●以2倍正常接種密度接種生長(cháng)活躍的細胞培養物到75%有血清培養基：25％SFM 混合培養基中，傳代培養。
●當細胞密度>5×105細胞/ml時(shí)，以2×105到3×105細胞/ml細胞密度，在有血清培養基：SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。
●以2×106到3×106細胞/ml細胞密度，25％有血清培養基和75% SFM中傳代培養。
●當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養基中傳代培養。
●每隔3到5天，當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml，細胞活率在90％時(shí)，貯備的適應了無(wú)血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。
建議備份前一次混合培養的培養物，直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養基中進(jìn)行幾次傳代。
在適應過(guò)程中，最好不要讓細胞生長(cháng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。
細胞培養適應替代血清：許多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1（v∶v）的混合培養基培養細胞。通過(guò)下列的混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養基。每次適應改變血清比例時(shí)，傳代細胞2到3次。
培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(cháng)的延遲可能會(huì )發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長(cháng)率恢復到以前的水平。
特別需要強調的是：配制無(wú)血清培養液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無(wú)血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養能否成功的關(guān)鍵因素之一。
三、使用無(wú)血清培養基的優(yōu)點(diǎn)
●增加確定性
●性能更加一致
●容易進(jìn)行純化和下游加工
●細胞功能的精確評估
●增強生長(cháng)和/或產(chǎn)量
●生理反應性的較好對照
●增強細胞內中介物的檢測
第六節 無(wú)蛋白培養基與限定化學(xué)成分培養基
一、無(wú)蛋白培養基（protein free midium,PFM）:即不含有動(dòng)物蛋白的培養基。無(wú)血清培養基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來(lái)看，不含動(dòng)物蛋白的培養基又廣泛的應用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應用于人體，如果再生長(cháng)過(guò)程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養基，純化過(guò)程就比較復雜，最終要達到一定的質(zhì)量標準也有一定的難度。無(wú)蛋白培養基就是為了適應這發(fā)展趨勢而出現的，許多無(wú)蛋白培養基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長(cháng)因子的作用。市場(chǎng)上已有適合多種細胞生長(cháng)的無(wú)蛋白培養基。
二、限定化學(xué)成分培養基(chemical defined medium,CDM):是指培養基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動(dòng)物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養基更有利于分析細胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長(cháng)的CDM問(wèn)世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養基就屬于CDM。
第七節 其他細胞培養用液
在細胞培養過(guò)程中，除了培養基外，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調整液等。
一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）:主要是由無(wú)機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養。主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。最簡(jiǎn)單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養相，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應注意。
配制溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過(guò)濾除菌或高溫滅菌。
二、消化液:取材進(jìn)行原代培養時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養時(shí)也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來(lái)，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時(shí)也用膠原酶（collagenase）溶液。
1.胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見(jiàn)有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因為這些物質(zhì)會(huì )對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應將液體調至pH8左右，充分溶解，過(guò)濾除菌。過(guò)濾后可以再調只pH7.5，也可不調。
使用細胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細胞清洗液（100ml細胞清洗液加0.5g胰酶），過(guò)濾除菌，分裝于4度保存。
2.EDTA溶液：EDTA溶液也常用來(lái)解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應加堿助溶，配制后可過(guò)濾除菌，也可高溫消毒滅菌。
3.膠原酶溶液：膠原酶在上皮類(lèi)細胞原代培養時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用PBS。
三、pH調整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
1.NaHCO3溶液：NaHCO3是培養基中必須添加的成分，一般情況下按說(shuō)明書(shū)的要求準確添加，以保證培養基在5%CO2的環(huán)境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達到平衡，所使用的培養基就不能按照說(shuō)明書(shū)所要求加入NaHCO3。此時(shí)常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調節培養基，使之達到所要求的pH環(huán)境。
2.HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無(wú)毒性，主要作用是防止培養基pH迅速變動(dòng)。在開(kāi)放式培養條件下，觀(guān)察細胞時(shí)培養基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養時(shí)要添加HEPES。
四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱(chēng)“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養基配制。
五、谷氨酰胺補充液:谷氨酰胺在細胞代謝過(guò)程中起重要作用，合成培養基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養液內。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時(shí)應加溫30℃，完全溶解后過(guò)濾除菌，分裝至小瓶，儲存于－20℃。使用時(shí)，在每100ml培養液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。
六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）
在細胞培養液中L-谷氨酰胺是大部分細胞培養基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩定的氨基酸，在中性的水溶液中會(huì )自發(fā)降解；需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。因而在培養操作過(guò)程中經(jīng)常：
（1）頻繁打開(kāi)蓋子，增加了破壞無(wú)菌狀態(tài)的可能性；
（2）過(guò)多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養基中氨的毒性水平。
二肽谷氨酰胺在細胞培養中穩定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!
二肽谷氨酰胺在細胞內被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細胞系統中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最優(yōu)替代物，它無(wú)需適應；既可用于貼壁細胞培養，也適合于懸浮細胞的培養。
