支原體（mycoplasma）：又稱(chēng)霉形體，在分類(lèi)學(xué)上是處于細菌和病毒之間的一種微生物，是目前發(fā)現的最小的最簡(jiǎn)單的原核生物。支原體細胞中唯一可見(jiàn)的細胞器是核糖體。支原體直徑一般在0.2-0.8 ?m之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。支原體缺乏細胞壁，有變形能力，能通過(guò)濾菌器、可在無(wú)生命培養基中生長(cháng)繁殖，在自然界分布極為廣泛?？蓪θ?、動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)等治病，造成極大危害。    支原體是細胞培養中常見(jiàn)的一種污染源。細胞培養中的支原體污染可能來(lái)自培養基、血清或實(shí)驗操作者，會(huì )影響細胞生長(cháng)率、細胞形態(tài)、基因表達、細胞代謝和細胞活力。支原體對細胞的影響，主要從兩方面考慮：一方面是對細胞的直接影響，細胞被支原體污染后，增殖緩慢，部分細胞變圓，從瓶壁上脫落，部分細胞雖然表面變化不十分明顯，實(shí)際上潛伏著(zhù)多方面的危險；另一方面，支原體可以通過(guò)消耗培養基中的精氨酸，抑制細胞DNA、RNA的合成，降低細胞的抵抗力?？偟膩?lái)說(shuō)，支原體污染對細胞造成的影響是多方面的：包括代謝、免疫或生化特性、生長(cháng)狀況、酶的作用途徑、細胞膜的組成、染色體結構、轉染效率、以及細胞存活等多方面的改變。 支原體能輕易地通過(guò)標準濾膜，同時(shí)也能拮抗絕大多數的抗生素。而且，支原體污染細胞后，培養液可不發(fā)生混濁，多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著(zhù)，細微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。因此，在細胞培養過(guò)程中，對支原體的防范、檢測和去除非常棘手，也非常重要。污染實(shí)驗室培養細胞的支原體主要有八種，通常用于細胞培養的絕大多數抗生素都對其無(wú)效。例如青霉素主要作用于細菌細胞壁，但支原體沒(méi)有細胞壁因此就不受影響。無(wú)懈可擊的細胞培養技術(shù)始終是預防支原體污染的最佳方式，另外及時(shí)找出受到支原體污染的培養物也很重要，這樣才能在污染擴散前快速采取有效措施。以下就為您介紹幾種在細胞培養中檢測支原體的常用方法。

1，  分離培養法

分離培養法是支原體檢測的金標方法，其檢測精確度最高。這種方法是從可疑的細胞培養體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長(cháng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì )在這種瓊脂平板上瘋狂生長(cháng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。分離培養法基本不會(huì )出現假陰性結果，因此被譽(yù)為支原體檢測金標準。不過(guò)分離培養法也存在兩個(gè)弊端，一是檢測時(shí)間太長(cháng)，支原體要長(cháng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。二是盡管可以檢測絕大多數支原體種類(lèi)，分離培養法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. hyorhinis尚不能在體外進(jìn)行培養，因而不能使用這個(gè)方法。如果你實(shí)在不想等這么久，或者希望在分離培養法的等待過(guò)程中先拿到初步結果，你可以試一試DNA、PCR或酶學(xué)檢測方法。不過(guò)需要注意的是，上述檢測方法都不能單獨檢出所有類(lèi)型的支原體，而且靈敏度也沒(méi)有分離培養法高，所以最好結合使用兩種方法以獲得最可靠的檢測結果。

2，  熒光法DNA檢測熒光法DNA檢測一般需要幾天時(shí)間。將可疑樣品與指示細胞共同培養，DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質(zhì)區域較大的Vero細胞，如果原樣本中含有支原體，那么當細胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時(shí)，就可以在指示細胞核周?chē)约凹毎ぶ車(chē)?、培養基中觀(guān)察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。分離培養法用來(lái)檢測支原體M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以準確的將其檢測出來(lái)。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是死亡細胞釋放出來(lái)的DNA會(huì )造成很大干擾，使得判斷誤差發(fā)生率大約在30%左右，因此使用這個(gè)方法需要一定的經(jīng)驗。

3，  PCR法

 PCR法可以檢測所有種類(lèi)的菌株，包括M. hyorhinis菌株。PCR法檢測支原體只需幾個(gè)小時(shí)，是最靈敏的支原體檢測方法。該方法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因的保守區域。在凝膠電泳過(guò)程中，支原體DNA會(huì )顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測所有種類(lèi)的支原體，快速，靈敏度最高，缺點(diǎn)是不能區分支原體的死活。而且因為PCR法過(guò)于靈敏，在操作過(guò)程中容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，所用的器具、槍頭、管壁等也都可能因為攜帶微量的支原體DNA而導致假陽(yáng)性現象。

4，  酶學(xué)檢測和ELISA

    酶學(xué)檢測是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內支原體的酶可以將ADP轉化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。這個(gè)方法的檢測速度最快，大概半小時(shí)即可完成，死亡的支原體不會(huì )造成干擾。缺點(diǎn)是靈敏度比PCR法低，而且需要的檢測發(fā)光的儀器尚未普及。ELISA也能用于支原體檢測，以ELISA法為基礎的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體，來(lái)檢測培養物中是否含有支原體。這個(gè)方法現在已較少使用。 支原體定期檢測支原體污染會(huì )使培養細胞慢慢枯萎，因此對培養細胞定期進(jìn)行支原體檢測非常重要。一般來(lái)說(shuō)每1至3個(gè)月就應該進(jìn)行一次例行支原體檢測。將定期支原體檢測常規化堅持下去，是細胞培養實(shí)驗室應對支原體污染的關(guān)鍵。對新引進(jìn)的細胞系應進(jìn)行檢測，防止引入外來(lái)的污染源。對于凍存的細胞，在凍存之前或者放入液氮之前進(jìn)行檢測，以免以將含支原體的細胞作為種源保存。如何預防支原體污染支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實(shí)驗器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細胞的原始組織或器官的污染。胞培養工作中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實(shí)驗操作；細胞培養基和器材要保證無(wú)菌；在細胞培養基中加入適量的抗生素。最好的預防支原體污染的方法就是嚴格操作，避免污染。