一、細胞計數
這是細胞培養中常用的基本技術(shù)之一。所用材料為血球計數板，巴氏吸管和顯微鏡。
細胞計數的基本步驟：
(1)取清潔計數板和專(zhuān)用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干.
(2)取細胞懸液0.3mL，加入0.9mL結晶紫(或臺盼至)染液，混勻后滴半滴于血球計數板內，以充滿(mǎn)不外溢為宜。也可直接將細胞懸液在一側滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過(guò)少或出現氣泡.
(3)在顯微鏡下用10×物鏡觀(guān)察計數四角大分格中的細胞數。代入下式得出細胞密度。
細胞數/ml=(4大格細胞數之和/4)×104×稀釋倍數
臺盼藍染色法可計算出活細胞數和死細胞數以測定細胞存活百分率。一般0.5%～1%的臺盼藍染液可使死細胞染成藍色，活細胞不著(zhù)色。此外還可用0.02%的藻紅B染液將死細胞或受損細胞染成紅色，或用0.05%的苯胺黑染液將死細胞染成黑色。
細胞存活百分率=（4大格活細胞數/4大格活細胞+死細胞數）×100%
細胞計數除用上述方法外，目前還有新型的自動(dòng)計數儀，可供大規模細胞計數工作使用。各種型號的計數操作不盡相同，可根據使用說(shuō)明進(jìn)行操作。
在進(jìn)行細胞計數操作時(shí)，必須把細胞懸液準備好，細胞應分散良好，并充分混勻，若出現較多細胞團或細胞數少于200個(gè)/10mm2或多于500個(gè)/10mm2時(shí)，需重制細胞懸液，重新計數。
二、細胞生長(cháng)曲線(xiàn)和生長(cháng)倍數
細胞生長(cháng)曲線(xiàn)是細胞培養實(shí)驗中最基本的指標，是測定細胞絕對增長(cháng)數值和生長(cháng)繁殖基本規律常用的簡(jiǎn)便方法。常用的方法為：在同一規格的培養瓶中，接種同等量的同一代細胞，經(jīng)培養后每隔24小時(shí)取出幾瓶細胞進(jìn)行計數，以培養時(shí)間為橫座標，不同時(shí)刻的細胞數的對數為底座標，標出各點(diǎn)并連成線(xiàn)，即為該細胞的生長(cháng)曲線(xiàn)，可反應出細胞生長(cháng)的動(dòng)態(tài)。
測定生長(cháng)曲線(xiàn)的另一種方法是用96孔/24孔細胞培養板，分7組，每組3孔，培養一周(7天)，期間逐日檢測一組，計數，最后把7天中的細胞數值繪成圖，即為細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。
也可采用MTT法來(lái)進(jìn)行生長(cháng)曲線(xiàn)測定，較上述方法簡(jiǎn)便。
標準的細胞生長(cháng)曲線(xiàn)近似“S”形，一般在傳代后第一天細胞數有所減少，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的潛伏期，再進(jìn)入對數生長(cháng)期，達到平臺期和生長(cháng)穩定，最后衰老。
細胞生長(cháng)倍數是指測定接種時(shí)活細胞的濃度，經(jīng)一個(gè)生長(cháng)周期達到最大活細胞濃度的比率。
生長(cháng)倍數=培養后最大活細胞濃度/接種時(shí)的活細胞濃度
三、細胞分裂指數
細胞分裂指數是表示細胞增殖旺盛程度的指標。它以被測1000個(gè)細胞中的分裂細胞數來(lái)計算。其方法為：用秋水仙素將細胞處理1～2小時(shí)后，按染色體制片法制片并染色，計算1000個(gè)細胞中分裂相的數目，重復4次取平均值，用百分比表示。
基本步驟：
(1)細胞準備 用蓋片(支持物)培養法。
(2)每24小時(shí)取出一個(gè)小玻片，按常規方法進(jìn)行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標本。
(3)顯微鏡下選擇細胞密度適中的區域觀(guān)察分裂細胞并計數。逐個(gè)視野進(jìn)行，對每一時(shí)間組的玻片各取細胞多、中、少3個(gè)區域各一區，共數1000個(gè)細胞，計算出平均分裂相值所占百分比。觀(guān)察時(shí)要掌握好分裂相標準，主要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以減少誤差。
細胞分裂指數=細胞分裂相數/細胞總數(1000)×1000
四、細胞接種存活率
細胞接種存活率又稱(chēng)細胞貼壁率。它是細胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5個(gè)細胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長(cháng)形成細胞小群(克隆)的細胞百分數值，用以表示細胞的生存能力和細胞群的活力。
基本步驟：
（1）取對生長(cháng)期細胞，用消化法制成細胞懸液，計數后按檢測細胞生長(cháng)曲線(xiàn)的接種細胞的原則，將細胞接種于培養瓶(濃度相對高些)。接種12～15瓶。
（2）每2小時(shí)取出一瓶細胞，倒掉培養液，然后加入胰酶消化已貼壁細胞，計數已貼壁細胞，用下面公式逐個(gè)計算每個(gè)時(shí)間上的貼壁率。每2小時(shí)一次，共觀(guān)察24小時(shí)即12。
接種存活率%(貼壁率)=(貼壁存活細胞數/接種細胞數)×100%
五、克隆形成率
細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數，但貼壁后的細胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞?？寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細胞生物學(xué)性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時(shí)，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續一周，隨時(shí)檢查，到細胞形成克隆時(shí)終止培養。
1、平板克隆形成試驗
基本步驟：
(1)取對數生長(cháng)期的單層培養細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養液中備用。
(2)將細胞懸液作梯度倍數稀釋?zhuān)赃m當的細胞密度(根據增殖能力)接種于培養皿中。一般分每皿50、100、200個(gè)細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動(dòng)，使細胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養2～3周。
(3)經(jīng)常觀(guān)察，當培養皿中出現肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。
(4)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個(gè)細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。
克隆數
克隆形成率= —————×100%
接種細胞數
平板克隆形成試驗方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(cháng)的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過(guò)大。
2、軟瓊脂培養克隆形成試驗
基本步驟：
(1)取對數生長(cháng)期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據實(shí)驗要求作梯度倍數稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會(huì )凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養10～14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀(guān)察細胞克隆數。計算形成率。
軟瓊脂培養法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過(guò)40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過(guò)35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細胞。正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。
