一、背景
破傷風(fēng)( tetanus) 是破傷風(fēng)桿菌侵入人體傷口后，在局部生長(cháng)繁殖并產(chǎn)生外毒素所致的急性疾病。近年來(lái)隨著(zhù)毒品成癮者越來(lái)越多采用注射方式吸毒，且其使用的注射針具可能被多種細菌污染，乃至因靜脈吸毒者發(fā)生破傷風(fēng)逐年增加，在某些經(jīng)濟發(fā)達和吸毒高發(fā)地區，甚至已成為破傷風(fēng)的主要傳播途徑。破傷風(fēng)是一種完全可預防的疾病，由于發(fā)展中國家的免疫不普及，大部分病例發(fā)生在發(fā)展中國家，且由于缺乏有效的治療方法，破傷風(fēng)仍是一種高死亡率的疾病，死亡率為 20 %～ 30%，重癥患者的死亡率可 高達70 %。而如美國等發(fā)達國家中亦有較高的發(fā)病率。
因此，破傷風(fēng)仍是一種嚴重危害人類(lèi)健康的疾病。破傷風(fēng)桿菌在自然界中分布極為廣泛，很多家畜糞便中都帶有破傷風(fēng)桿菌，人糞中也常帶菌。細菌的芽胞常存在于土壤，污泥和塵埃中。不同類(lèi)型和大小的傷口均可成為破傷風(fēng)桿菌的入侵門(mén)戶(hù)。
破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌 ( Clostridium tetani，簡(jiǎn)稱(chēng)為破傷風(fēng)桿菌) 是一種革蘭陽(yáng)性厭氧芽胞桿菌，是破傷風(fēng)( Tetanus) 的病原菌。它侵入傷口內繁殖、分泌內毒素且引起急性的特異性感染，主要表現為全身或局部肌肉的持續性收縮和陣發(fā)性痙攣。1962 年，Latham 開(kāi)發(fā)出了適合破傷風(fēng)芽胞桿菌生長(cháng)的半合成培養基，此培養基含有胰酶消化酪蛋白，至今仍廣泛使用。
二、致病性
破傷風(fēng)桿菌能產(chǎn)生兩種在氨基酸結構上基本相似的外毒素，即 溶血 毒素 ( Hemotoxin)和破傷風(fēng)痙攣毒素( tetanospasmin)。溶血毒素在功能和抗原性與鏈球菌溶血毒類(lèi) O 相似，目前此毒素在破傷風(fēng)致病中的作用尚未明確。破傷風(fēng)痙攣毒素是一種蛋白質(zhì)，不耐熱，56 30min即可被破壞?？杀荒c道中存在的蛋白酶所降解，故口服該毒素無(wú)致病作用。
痙攣毒素在菌體內合成時(shí)是一條多肽鏈，分子量 160KDa，可在蛋白水解酶作用下裂解成一條輕鏈(分子量為 55KDa)和 一條重鏈 (分子量為105KDa)，兩條肽鏈分開(kāi)后，各部分的血清學(xué)特性仍存在，但其毒性消失，重新聯(lián)合時(shí)又恢復其毒性。重鏈是毒素與神經(jīng)細胞表面的神經(jīng)節苷酯結合部位，輕鏈則具有毒性作用，但必須與重鏈聯(lián)合方能致病。破傷風(fēng)痙攣毒素是由一個(gè)大質(zhì)粒編碼，整個(gè)毒素基因有 3945 核苷酸，編碼 1315 的氨基酸，其中有一段約 20 個(gè)氨基酸部分無(wú)毒性作用，是刺激人類(lèi) T 細胞增殖的決定簇。
破傷風(fēng)的發(fā)病機制是破傷風(fēng)桿菌芽胞進(jìn)入缺氧的創(chuàng )口后，在局部發(fā)芽繁殖產(chǎn)生痙攣毒素，此毒素通過(guò)外周神經(jīng)纖維間隙，或通過(guò)血液，淋巴液等途徑到達中樞神經(jīng)系統，毒素通過(guò)重鏈與脊髓及腦干組織細胞表面的神經(jīng)節苷脂結合并進(jìn)入細胞，通過(guò)輕鏈的毒性作用抑制突觸未端釋放神經(jīng)介質(zhì)，抑制了正常的調節功能，產(chǎn)生特有的破傷風(fēng)臨床表現。
三、培養
傳統的破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養基，一般含肉類(lèi)(乳牛心浸液 BHI) 或乳類(lèi)( 酪蛋白消化液中的 N-ZCaseR或 N-Z-CaseTTR) 制品，其他還有葡萄糖、氨基酸、維生素、尿嘧啶和無(wú)機鹽等。已經(jīng)明，N-ZCaseR或 N-Z-CaseTTR對細菌生長(cháng)是必需的。目前使用的干酪素胰酶消化液(胰酪消化液)和胃酶牛肉消化液(濃胨水) 是作為破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養基氮源的主要原材料，但是隨著(zhù)生產(chǎn)規模的擴大，制作一批基礎液已經(jīng)不能保證生產(chǎn)的連續多批次使用。為解決上述問(wèn)題，從 2008 年開(kāi)始將破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養基的主要原材料胰酪消化液、濃胨水、豬肝水透析外液用商品化的類(lèi)似原材料代替。
先保持胰酪消化液、濃胨水和其他組分不變，嘗試應用肝浸粉替代豬肝水透析外液，并從培養基制備量小( 60 L)逐步擴大到制備量為 120 L、300 L、700 L 各 6 批，通過(guò)生化檢測和破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒水平試驗，同時(shí)用豬肝水透析外液的培養基接種破傷風(fēng)桿菌的產(chǎn)毒水平進(jìn)行對比，其結果顯示差異無(wú)統計學(xué)意義。因此，用肝浸粉可以替代豬肝水透析外液。
接著(zhù)嘗試應用胰酪胨替代胰酪消化液制備破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養基 11 批，試驗產(chǎn)量為 18L，同時(shí)以胰酪消化液和濃胨水為基礎液的培養基 540 L，對其生化指標質(zhì)量控制和接種破傷風(fēng)桿菌的產(chǎn)毒情況進(jìn)行了比較： 2009 年，用胰酪胨和不同的月示胨作試驗培養基，同時(shí)用胰酪消化液和濃胨水為基礎液的培養基 540～670 L，對質(zhì)量控制生化指標和細菌產(chǎn)毒情況進(jìn)行了對比，選擇出一種可用的月示胨以替代原來(lái)的濃胨水。
2010 年上半年菌種用培養基沿用傳統的原材料配制，試驗選用胰酪胨和月示胨制備破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養基制備量 54 L 30 批次，同時(shí)使用胰酪消化液和濃胨水為基礎液進(jìn)行質(zhì)量控制和破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒水平對比： 2010 年下半年菌種用培養基選用胰酪胨和月示胨，試驗選用胰酪胨和月示胨制備破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養基，制備量依次為 36、72、500和 520 L 各 3 批次逐漸擴大，檢測培養基的質(zhì)量控制生化指標和產(chǎn)毒情況進(jìn)行試驗，完成從小量到大量的原材料替代試驗。
而 2012 年，選用的胰酪胨和月示胨替代傳統自制的胰酪消化液和濃胨水制備破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒培養基，大罐制備量為 500 L 共 48 批次，其培養基檢測的各項生化指標穩定，產(chǎn)毒能力良好，表明肝浸粉、胰酪胨和月示胨替代傳統原材料制備的培養基易于生化指標的質(zhì)量控制，可適用于破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)毒規?；纳a(chǎn)。
四、抗菌方法
有實(shí)驗構建和純化抗破傷風(fēng)桿菌信息菌素（pH-CT），并初步檢測其抗菌活性。從分泌針對破傷風(fēng)桿菌表面抗原的單克隆抗體的雜交瘤細胞中擴增出抗體可變區基因序列，利用雙聯(lián)寡核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)將抗體模擬物與大腸菌素融合構建pH-CT，經(jīng)離子交換柱純化后，通過(guò)菌落培養加入不同劑量信息菌素pH-CT（ 終濃度2、4、8、16μg/mL），觀(guān)察pH-CT 的體外抗菌活性。通過(guò)培養液中接種破傷 風(fēng)桿菌，并加入不同劑量的pH-CT（ 終濃度4、16μg/mL），厭氧培養16h后取濾液及菌液行小鼠腹腔注射，觀(guān)察pH-CT 的體內抗菌活性。
結果成功構建抗破傷風(fēng)桿菌pH-CT。體外實(shí)驗結果顯示，涂布加入pH-CT2、4μg/mL 孵育菌液的固體培養基上仍見(jiàn)破傷風(fēng)菌落生長(cháng)，而涂布加入pH-CT8、16μg/mL 孵育菌液的培養基上均無(wú)菌落生長(cháng)；體內實(shí)驗結果顯示，濾液和菌液組中對照組小鼠1d內均全部死亡，濾液組pH-CT4、16μg/mL 組小鼠3d內全部存活，菌液組中pH-CT４μg/mL組小鼠3d內存活3只（50％），pH-CT16μg/mL 組小鼠3d內全部存活。因此構建的pH-CT在體內和體外都表現出對破傷風(fēng)桿菌有抗菌活性，為臨床治療破傷風(fēng)提供了新思路和新途徑，具有應用于臨床的潛在價(jià)值。
