現代生物技術(shù)一般認為包括基因工程技術(shù)、細胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細胞培養有密切關(guān)系，特別是在醫藥領(lǐng)域的發(fā)展，細胞培養更具有特殊的作用和價(jià)值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過(guò)程中很多是通過(guò)細胞培養來(lái)實(shí)現的?；蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且訡HO細胞作為載體；細胞工程中更是離不細胞培養，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過(guò)細胞培養來(lái)實(shí)現的，既使是現在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開(kāi)細胞培養。正在倍受重視的基因治療、體細胞治療也要經(jīng)過(guò)細胞培養過(guò)程才能實(shí)現，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細胞培養密切相關(guān)?？傊?，細胞培養在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。
第一節 體外培養的概念
一、基本概念 體外培養（in vitro culture），就是將活體結構成分或活的個(gè)體從體內或其寄生體內取出，放在類(lèi)似于體內生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長(cháng)和發(fā)育的方法。
●組織培養：是指從生物體內取出活的組織（多指組織塊）在體外進(jìn)行培養的方法。
●細胞培養：是指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進(jìn)行培養的方法。
●器官培養：是指從生物體內取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進(jìn)行培養的方法。
二、體內、外細胞的差異和分化
1.差異：細胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調節和細胞間的相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對穩定環(huán)境中，日久天長(cháng)，易發(fā)生如下變化：分化現象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉化獲得不死性，變成可無(wú)限生長(cháng)的連續細胞系或惡性細胞系。因此，培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著(zhù)與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞的性狀。實(shí)際上從細胞一旦被置于體外培養后，這種差異就開(kāi)始發(fā)生了。
2.分化：體外培養的細胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細胞分化的表現和在體內不同。細胞是否表現分化,關(guān)鍵在于是否存在使細胞分化的條件，如Friend細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內皮細胞在類(lèi)似基膜物質(zhì)底物上培養時(shí)能長(cháng)成血管狀結構，雜交瘤細胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細胞分化行為。
第二節 細胞培養的一般過(guò)程
一、準備工作 準備工作對開(kāi)展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節的疏忽可導致實(shí)驗失敗或無(wú)法進(jìn)行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無(wú)菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試。
二、取材 在無(wú)菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實(shí)驗目的而定），經(jīng)過(guò)一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養器血中，這一過(guò)程稱(chēng)為取材。如是細胞株的擴大培養則無(wú)取材這一過(guò)程。機體取出的組織細胞的首次培養稱(chēng)為原代培養。
理論上講各種動(dòng)物和人體內的所有組織都可以用于培養，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時(shí)，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養液中保存。取組織時(shí)應嚴格保持無(wú)菌，同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時(shí)容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。
三、培養 將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過(guò)程稱(chēng)為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進(jìn)行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進(jìn)入培養器皿后，立即放入培養箱中，使細胞盡早進(jìn)入生長(cháng)狀態(tài)。
正在培養中的細胞應每隔一定時(shí)間觀(guān)察一次，觀(guān)察的內容包括細胞是否生長(cháng)良好，形態(tài)是否正常，有無(wú)污染，培養基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度和CO2濃度也要定時(shí)檢查。
原代培養一般有一段潛伏期（數小時(shí)到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過(guò)了潛伏期后細胞進(jìn)入旺盛的分裂生長(cháng)期。細胞長(cháng)滿(mǎn)瓶底后要進(jìn)行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱(chēng)為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無(wú)限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無(wú)惡性。
四、凍存及復蘇（可參閱后面有關(guān)章節）為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時(shí)間幾乎是無(wú)限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進(jìn)行培養。
凍存過(guò)程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時(shí)溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
五、常用儀器設備 無(wú)菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養箱,培養器具，CO2培養箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機,無(wú)菌過(guò)濾器,洗刷裝置,細胞計數板和電子細胞技術(shù)儀等等。
第三節 細胞培養的無(wú)菌環(huán)境
一、無(wú)菌室
無(wú)菌室的結構：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。
無(wú)菌室的消毒和防污染：為保持無(wú)菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小時(shí)），每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。實(shí)際工作中，要根據無(wú)菌室建筑材料的差異來(lái)選擇合適的消毒方法。
此外，還應注意防止無(wú)菌室的污染。造成無(wú)菌室污染的可能包括：送入無(wú)菌室的風(fēng)沒(méi)有被過(guò)濾除菌；進(jìn)出無(wú)菌室時(shí)，能使外界空氣直接對流進(jìn)無(wú)菌室的操作間；等。
二、超凈工作臺
工作原理：鼓風(fēng)機驅動(dòng)空氣通過(guò)高效過(guò)濾器得以?xún)艋?，凈化的空氣被徐徐吹過(guò)臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區構成無(wú)菌環(huán)境。根據氣流在超凈工作臺的流動(dòng)方向不同，可將超凈工作臺分為側流式、直流式和外流式三種類(lèi)型。
超凈臺的使用與保養：超凈臺的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜，過(guò)大、過(guò)小均不利于保持凈化度；使用前最好開(kāi)啟超凈臺內紫外燈照射10－30分鐘，然后讓超凈臺預工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈，以保證超凈臺無(wú)菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。
第四節 常用培養器皿及清洗消毒
細胞培養需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類(lèi)、紙類(lèi)等，因此掌握清洗、消毒知識，學(xué)會(huì )清洗、消毒方法是從事細胞培養工作必須的。
一、清洗 離體條件下，有害物質(zhì)直接同細胞接觸，細胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認真清洗，達到不含任何殘留物的要求。
（一）玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過(guò)浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟。
1.浸泡:新的或用過(guò)的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著(zhù)物。新玻璃器皿使用前得先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5％鹽酸浸泡過(guò)夜；用過(guò)的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應立即浸入清水中備刷洗。
2.刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。
3.浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱(chēng)酸液，通過(guò)酸液的強氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應少于六小時(shí)，一般過(guò)夜或更長(cháng)。放取器皿要小心。
4.沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細胞培養的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包裝備用。
（二）橡膠制品清洗
新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。
（三）塑料制品的清洗
塑料制品特點(diǎn)：質(zhì)軟、易出現劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來(lái)水過(guò)夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時(shí)，晾干備用。
（四）包裝:對細胞培養用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。
二、消毒和滅菌 微生物污染是造成細胞培養失敗的主要原因
（一）物理消毒法
1.紫外線(xiàn)消毒:紫外線(xiàn)是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽(yáng)性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強。紫外線(xiàn)的直接作用是通過(guò)破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過(guò)紫外線(xiàn)照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養室消毒，用法簡(jiǎn)單，效果好。
紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時(shí)間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2－3小時(shí)，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長(cháng)照射時(shí)間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應超過(guò)1.5米，照射時(shí)間30分鐘為宜。
紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養細胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開(kāi)著(zhù)紫外等操作。
2.高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類(lèi)、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養液都可以用這方法滅菌。
不同壓力蒸汽所達到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時(shí)間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應立即放到60-70℃烤箱內烘干，再貯存備用，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡(jiǎn)單、使用方便等特點(diǎn)。
3.高溫干熱消毒:干熱滅菌主要是將電熱烤箱內物品加熱到160℃以上，并保持90－120分鐘，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。
干熱滅菌后要關(guān)掉開(kāi)關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開(kāi)，切忌立即打開(kāi)，以免溫度驟變而使箱內的玻璃器皿破裂。干烤箱內物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。
燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。
4.過(guò)濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過(guò)濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。在體外培養時(shí)，過(guò)濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養液。目前，大多實(shí)驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程。
（二）化學(xué)消毒：新潔而滅，其0.1％水溶液可對器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒。
（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養液，是培養過(guò)程中預防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應根據需要選擇。
可用于細胞培養的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應范圍。如常用的過(guò)濾除菌系統、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實(shí)驗室空氣；多用新潔而滅消毒實(shí)驗室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過(guò)濾除菌方法消毒培養液。
