大腸菌群是經(jīng)常用來(lái)衡量食品衛生情況的重要指標，絕大部分食品都會(huì )要求檢測的項目。在食品微生物實(shí)驗室里，大腸菌群和菌落總數的檢測頻次應該是最高的，但檢測過(guò)程中總會(huì )有一些小問(wèn)題困擾著(zhù)大家，以下來(lái)講解一下大腸菌群平板計數法的注意事項。
一、方法的選擇
相比于MPN計數法，平板計數法更適用于大腸菌群含量較高的食品。但大腸菌群多少算是含量較高呢？國標里沒(méi)有明確規定，但通常認為，產(chǎn)品大腸菌群以100CFU/g（mL）為界，超過(guò)這個(gè)含量一般認為是含量較高。但具體什么時(shí)候選用平板計數法進(jìn)行大腸菌群的檢測，大部分情況還是要看你的產(chǎn)品執行的標準。假如產(chǎn)品標準要求大腸菌群含量的單位為CFU/g（mL），那必須選用平板計數法。若是/g(mL)或者M(jìn)PN/100g(mL)，就應選擇MPN計數法，MPN法具體選用哪版國標此處不再贅述。因此，根據自己產(chǎn)品的情況選擇適當的檢測方法。
二、培養基的要求
平板計數法使用的培養基為結晶紫中性膽鹽瓊脂培養基，簡(jiǎn)稱(chēng)VRBA。無(wú)論是國標，還是培養基的使用說(shuō)明中都明確表示，VRBA是不需要進(jìn)行滅菌的，煮沸2min即可使用。特地點(diǎn)出這一點(diǎn)是因為很多朋友都在問(wèn)VRBA的滅菌條件，對不滅菌的培養基不信任，害怕出現檢測異常，那是因為這些小伙伴們對其中的原理不清楚。大腸菌群的定義是在一定培養條件下能夠在發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，因此大腸菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培養基煮沸的過(guò)程中，即使有大腸菌群存在也會(huì )被殺滅，所以從培養基帶入污染的可能性是沒(méi)有的。當然盛裝培養基的容器是需要進(jìn)行滅菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一種選擇性的培養基，含有的結晶紫對革蘭氏陽(yáng)性菌有比較強的抑制作用而對革蘭氏陰性菌幾乎沒(méi)有作用，而且平板培養產(chǎn)生的菌落還需要進(jìn)行復發(fā)酵的驗證，因此VRBA培養基就不需要進(jìn)行滅菌了。但值得注意的是，VRBA需要現配現用，配制出的培養基應當在3h之內使用完畢。
三、稀釋度的確定
國標中要求選擇2-3個(gè)適宜的連續稀釋度。什么樣的稀釋度是合適的呢？這要根據計數來(lái)決定。計數環(huán)節要求選擇菌落數在15CFU-150CFU的平板進(jìn)行計數，因此培養后菌落數在這個(gè)范圍內的稀釋度就是適宜的稀釋度。實(shí)驗室經(jīng)常檢測的產(chǎn)品的大腸菌群的水平檢測人員可以預計的，但是對盲樣，我們能做的只有根據實(shí)際情況多檢測幾個(gè)稀釋度了。這里需要提一句，液體樣品的檢測稀釋度可以包括原液。
四、證實(shí)試驗
需要從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落，少于10個(gè)菌落的挑取全部的典型和可疑菌落進(jìn)行BGLB肉湯管驗證。這里挑取的菌落也是應當有選擇的，典型菌落和可疑菌落的比例應當與平板上培養的兩種菌落的比例相同或相近，這樣能夠降低檢測過(guò)程中的誤差。
五、計數的報告
報告過(guò)程是很多朋友存在疑問(wèn)的地方，因為平板計數法的結果報告需要結合培養基菌落數和復發(fā)酵驗證兩方面進(jìn)行計算。存在疑問(wèn)的情況主要有以下幾種：
1、所有稀釋度都不在計數范圍內怎么辦？
這種情況一般都是最低稀釋度的平板都小于15CFU，這種情況就是以最低稀釋度的平板菌落數乘以驗證試驗的比例來(lái)計算。例如10倍稀釋的兩個(gè)平板上菌落數分別為10、8，菌落數為10的平皿挑取10個(gè)菌落復發(fā)酵中有8個(gè)菌落產(chǎn)氣，菌落數為8的平皿挑取8個(gè)菌落復發(fā)酵中有7個(gè)菌落產(chǎn)氣，則計算過(guò)程是這樣的：(10*8/10+8*7/8)/2*10=75CFU/g（mL）。
2、連續兩個(gè)稀釋度的四個(gè)平皿的菌落數都在計數范圍內怎么辦？
這個(gè)需要參考菌落總數檢測國標里7.1.2里的公式計算。我們需要先計算每個(gè)平皿的驗證后的菌落數，再代入公式計算即可。例如10倍稀釋度兩個(gè)平皿菌落數為120和125,100倍稀釋度兩個(gè)平皿的菌落數為17和16，經(jīng)過(guò)復發(fā)酵驗證產(chǎn)氣的管數分別為7、8、8、8，則我們先計算每個(gè)平皿上的菌落數分別為120*7/10=84,125*8/10=100,17*8/10=13.6（我們計14），16*8/10=12.8（我們計13），然后將84、100、14、13四個(gè)數代入公式：（84+100+14+13）/（2+0.2）*10=959，結果應報告960CFU/g（mL）。
3、只有一個(gè)稀釋度的一個(gè)平皿的菌落數在計數范圍，其他均不在計數范圍怎么辦？
這樣我們只需要復發(fā)酵驗證這一個(gè)平皿即可，根據這一個(gè)平皿的菌落數進(jìn)行報告。例如10倍稀釋度兩個(gè)平皿菌落數為160和142,100倍稀釋度兩個(gè)平皿的菌落數為12和13，則我們只需要從菌落數為142CFU的平皿里挑取10個(gè)菌落進(jìn)行復發(fā)酵驗證即可，假如共有7支發(fā)酵管陽(yáng)性，則應計算142*7/10=99.4，結果報告99CFU/g（mL）。
其實(shí)只要是平板菌落計數的相關(guān)問(wèn)題，我們都應按照GB 4789.1-2016里要求的結果與報告要求進(jìn)行計算和報告即可，無(wú)論那種情況，都是萬(wàn)變不離其宗的。
